Nuevos recubrimientos comestibles antifúngicos para controlar la antracnosis y mantener la calidad poscosecha de los cítricos
Autores:
V. Martínez–Blay, M.B. Pérez–Gago, L. Palou
Centre de Tecnologia Postcollita (CTP), Institut Valencià d’Investigacions Agràries (IVIA), Montcada, València.
Publicado en Revista de Fruticultura nº82
RESUMEN
Colletotrichum gloeosporioides es el agente causal de la antracnosis de los cítricos. En este trabajo se evaluó la actividad antifúngica in vitro en placas de PDA de aditivos alimentarios contra este patógeno y los aditivos y concentraciones más efectivos se ensayaron como ingredientes antifúngicos de recubrimientos comestibles (RCs) compuestos formulados a base de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y cera de abeja (BW). Los RCs con sorbato potásico (PS), benzoato sódico (SB) y silicato potásico (PSi), todos al 2%, fueron los más efectivos para controlar la enfermedad en mandarinas y naranjas inoculadas artificialmente. Estos RCs antifúngicos no afectaron negativamente a la calidad fisicoquímica y sensorial de naranjas ‘Valencia Late’ no inoculadas y frigoconservadas hasta 2 meses a 5ºC y 90% HR.
Palabras clave: Cítricos, Poscosecha, Aditivos alimentarios, Colletotrichum gloeosporioides.
ABSTRACT
New antifungal edible coatings to control anthracnose and preserve citrus postharvest quality. Colletotrichum gloeosporioides is the causal agent of citrus postharvest anthracnose. We evaluated in this work the in vitro antifungal activity on PDA plates of food additives against this pathogen and the most effective additives and concentrations were selected as antifungal ingredients of composite edible coatings (ECs) formulated with hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) and beeswax (BW). ECs containing potassium sorbate (PS), sodium benzoate (SB) or potassium silicate (PSi), all at a concentration of 2%, were the most effective to control disease on artificially inoculated mandarins and oranges. These antifungal ECs did not adversely affect the physicochemical and sensory quality attributes of non-inoculated ‘Valencia’ oranges cold-stored for up to 2 months at 5ºC and 90% RH.
Key words: Citrus, Postharvest, Food additives, Colletotrichum gloeosporioides.
La producción citrícola (Citrus spp., Rutaceae) mundial supera los 130 millones de toneladas. España es el sexto productor de cítricos en fresco, superando los 6 millones de toneladas, y el primero en exportación (FAOSTAT, 2020). Las enfermedades de poscosecha de los cítricos son causadas por hongos patógenos que infectan la fruta antes, durante o después de la cosecha pero que se desarrollan tras la recolección, representando un riesgo económico continuo para el sector. La antracnosis de poscosecha, causada por Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., se inicia con infecciones latentes de campo en el fruto que se ven favorecidas por temperaturas y humedades relativas (HR) elevadas. Sus síntomas son manchas oscuras en el fruto que pueden ocupar gran parte de su superficie y mostrar masas de conidios de color salmón (Smilanick et al., 2020) (Foto 1).


Foto 1. Mandarinas ‘Nadorcott’ inoculadas artificialmente con el hongo Colletotrichum gloeosporioides, causante de la antracnosis de los cítricos.
La extensión mediante frigoconservación de la vida poscosecha de los cítricos es una gran herramienta para prolongar el periodo comercial, pero si se realiza en condiciones no adecuadas o por periodos demasiado largos puede incidir negativamente en la calidad de la fruta y aumentar la incidencia de enfermedades de poscosecha como la antracnosis. Los recubrimientos comestibles (RCs) pueden reducir el deterioro de frutas y hortalizas al crear una barrera semipermeable frente a gases, reduciendo la respiración y la pérdida de peso y firmeza, y además actuar de soporte de sustancias activas, como agentes antimicrobianos (Valencia–Chamorro et al., 2011). Por otro lado, numerosos estudios han demostrado el potencial de distintas sales orgánicas e inorgánicas, aprobadas como aditivos alimentarios por la ‘European Food Safety Authority’ (EFSA), para controlar las principales enfermedades poscosecha de los cítricos, utilizados tanto como soluciones acuosas como ingredientes de RCs (Palou, 2018). Así, la incorporación de aditivos alimentarios con acción antifúngica a RCs a base de hidroxipropil metilcelulosa (HPMC) y lípidos ha emergido en los últimos años como una alternativa viable y no contaminante frente a tratamientos poscosecha tradicionales como las ceras formuladas con fungicidas químicos (Fagundes et al., 2013; Guimarães et al., 2019).
Los objetivos de este trabajo fueron: (1) evaluar la actividad antifúngica in vitro de varios aditivos alimentarios contra C. gloeosporioides y (2) desarrollar nuevos RCs estables a base de HPMC, cera de abeja (BW) y aditivos previamente seleccionados para controlar en ensayos in vivo la antracnosis de los cítricos y mantener la calidad fisicoquímica y sensorial de fruta frigoconservada a 5ºC.
Aditivos alimentarios antifúngicos. Ensayos ‘in vitro’
Se probaron las sales bicarbonato amónico [ABC, NH4HCO3, E–503 (ii)], carbonato amónico [AC, (NH4)2CO3, E–503 (i)], bicarbonato potásico [PBC, KHCO3, E–501 (ii)], carbonato potásico [PC, K2CO3, E–501 (i)]), silicato potásico (PSi, K2SiO3, E–560), sorbato potásico (PS, C6H7O2K, E–202), benzoato sódico (SB, C7H5O2Na, E–211), etilparabeno sódico (SEP, C9H9NaO3, E–215), metilparabeno sódico (SMP, C8H7NaO3, E–219) y propionato sódico (SP, CH3CH2COONa, E–281).
Se utilizó la cepa NAV–1 de C. gloeosporioides aislada e identificada a partir de naranjas infectadas procedentes de la zona citrícola de Valencia. Esta cepa forma parte de la colección de patógenos del CTP del IVIA y también está depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT, Universidad de Valencia) con el número de acceso CECT 21107. Antes de los ensayos, el hongo se incubó de 7 a 14 días en agar de patata y dextrosa (PDA) (Foto 2).


Foto 2. Crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides en placas Petri con medio agar de patata y dextrosa (PDA).
El crecimiento in vitro de C. gloeosporioides (diámetro de colonia) se evaluó en placas Petri de 90 mm con medio PDA modificado con soluciones acuosas de los aditivos a las concentraciones (p/v) de 0,2, 1,0 y 2,0% (0,01, 0,05 y 0,10% para SEP y SMP). El centro de cada placa se inoculó con un tapón micelial de 5 mm de diámetro (cultivos del hongo de 7–14 días), obtenido con un sacabocados estéril. Se usaron 4 réplicas (placas) por aditivo y concentración. Como controles se inocularon placas Petri conteniendo solo PDA. Se evaluó la reducción del crecimiento micelial respecto al control (%) tras 7 días de incubación a 25ºC.
Preparación de recubrimientos con aditivos alimentarios antifúngicos
Los RCs consistieron en emulsiones a base de HPMC y BW formuladas con aditivos alimentarios efectivos in vitro y seleccionados por su capacidad para formar emulsiones estables: AC (0,2%), PS (2%), PC (0,2%), SMP (0,1%), SEP (0,1%), SB (2%) y PSi (2%). Todos los RCs contuvieron 1,3% de HPMC (p/p, base húmeda, bh), 3% de BW (bh), ratios constantes de HPMC–plastificante (2:1, glicerol) y BW–emulsificante (3:1, ácido esteárico o Tween–80 para SEP y SMP) y una concentración de sólidos constante del 6%. Estas emulsiones se prepararon a 95ºC con un homogeneizador de alta velocidad.
Efectividad de los recubrimientos en el control de la antracnosis
Se evaluó la capacidad de control de la antracnosis de los RCs, formulados con los aditivos mencionados en el apartado anterior, en mandarinas ‘Nadorcott’ y en naranjas ‘Valencia Late’ inoculadas artificialmente, mediante una herida (1x2 mm) en la zona ecuatorial del fruto con un punzón sumergido previamente en una suspensión de 2x106 esporas/mL de C. gloeosporioides (Foto 3). Tras 24 h a 25ºC, los frutos se recubrieron manualmente depositando 300 μL de emulsión en la superficie de cada uno de ellos y distribuyéndola homogéneamente con las manos simulando la aplicación en los rodillos giratorios de una línea de confección comercial (Foto 4). Los controles fueron frutos inoculados sin recubrir. Cada tratamiento se aplicó a 4 repeticiones de 10 frutos. Se determinó la severidad de la enfermedad (diámetro de lesión, en mm) tras 15 días de incubación a 25ºC.


Foto 3. Inoculación artificial de mandarinas ‘Nadorcott’ en una herida de la piel con una suspensión de esporas de Colletotrichum gloeosporioides.


Foto 4. Tratamiento manual de naranjas ‘Valencia Late’ con recubrimientos comestibles antifúngicos emulando la aplicación comercial en los rodillos de una línea de confección de cítricos.
Efecto de los recubrimientos seleccionados en la calidad de naranjas frigoconservadas
Los tres RCs más efectivos en el control de la antracnosis fueron seleccionados y se evaluó su efecto sobre la calidad de naranjas ‘Valencia Late’ sin inocular conservadas a 5ºC. Tras 28 y 56 días a 5ºC y 90% HR, seguidos de 7 días de simulación de vida comercial a 20ºC, se determinaron los siguientes parámetros de calidad: pérdida de peso (%, n=20), firmeza (% deformación corteza, n=20), índice de madurez (IM=CSS/AT; CSS: contenido en sólidos solubles, ºBrix; AT: acidez titulable, % ácido cítrico; n=15), concentración de CO2 (% CO2, n=10) y volátiles (mg/L de etanol y acetaldehído, n=15). También se realizó una valoración sensorial, evaluándose (n=4): sabor global (1=pobre a 9=óptimo), malos sabores (1=ausencia a 5=pronunciados) y apariencia externa (1=mala a 3=buena).
Análisis estadístico
Todos los resultados se procesaron mediante análisis de varianza (ANOVA). Para la separación de medias se utilizó la prueba de la Mínima Diferencia Significativa de Fisher (MDS), al 95% de confianza (P = 0,05). Todos los análisis se realizaron con el programa Statgraphics Centurion XVII.
Ensayos ‘in vitro’
El Cuadro 1 muestra que en las pruebas in vitro se obtuvieron diferencias significativas en la capacidad inhibitoria de las distintas sales y un efecto dependiente de la concentración, siendo más efectivas a mayor dosis. Destaca la inhibición total del crecimiento a los 7 días con SMP (0,1%), SEP (0,1%) y ABC (2%). Estudios previos ya habían demostrado la efectividad de carbonatos y parabenos para inhibir el crecimiento in vitro de una gran variedad de patógenos poscosecha como C. gloeosporioides (Hasan et al., 2012), Colletotrichum musae (Berk. & Curtis) Arx. (De Costa y Gunawardhana, 2012), Botrytis cinerea Pers. (Alaoui et al., 2017), Monilinia fructicola (G. Wint.) Honey (Karaca et al., 2014) o Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl. (Guimarães et al., 2019). Sin embargo, debido a distintos factores, estos aditivos no siempre pueden integrarse como ingredientes de un RC (Guimarães et al., 2019). Por ello, solo fueron seleccionados aditivos efectivos in vitro que presentaron capacidad para formar emulsiones estables al incorporarse a matrices de HPMC–BW.


Cuadro 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial in vitro de Colletotrichum gloeosporioides en placas Petri con medio PDA modificado con aditivos alimentarios, después de 3, 5 y 7 días de incubación a 25ºC.
1 Ver apartado 1 de Material y métodos.
2 Reducción del diámetro de la colonia respecto al tratamiento control (placas con PDA solo). Las medias en la misma columna con diferentes letras son significativamente distintas según la prueba de la MDS de Fisher aplicada después de un ANOVA (P < 0,05).
Efectividad de los recubrimientos en el control de la antracnosis
En la Figura 1 se representa la actividad curativa frente a la antracnosis de cítricos de RCs a base de HPMC–BW conteniendo los aditivos: AC (0,2%), PS (2%), PC (0,2%), SMP (0,1%), SEP (0,1%), SB (2%) o PSi (2%). Los resultados muestran que los RCs ensayados redujeron en un 50–70% la severidad de la antracnosis respecto al control en mandarinas ‘Nadorcott’ y en un 10–35% en naranjas ‘Valencia Late’, siendo los RCs con PS, SB y PSi al 2% los más efectivos. Por ello, estos tres RCs se seleccionaron para estudiar su efecto en la calidad de naranjas frigoconservadas.


Figura 1. Porcentaje de reducción de la severidad (diámetro de la lesión) de la antracnosis, respecto al control, en mandarinas ‘Nadorcott’ (A) y naranjas ‘Valencia Late’ (B) inoculadas artificialmente con Colletotrichum gloeosporioides y recubiertas 24 h después con recubrimientos comestibles a base de hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), cera de abeja (BW) y aditivos alimentarios (ver apartado 2 de Material y métodos), tras su incubación durante 15 días a 25ºC. Severidad promedio de los controles: mandarinas = 47,29 mm, naranjas = 15,2 mm.
Las columnas con letras diferentes indican medias significativamente diferentes según la prueba de la MDS de Fisher aplicada después de un ANOVA (P < 0,05). Las líneas verticales encima de las columnas indican el error estándar (SE).
Es destacable que la capacidad antifúngica de los RCs fue mayor en las especies de cítricos más susceptibles a la antracnosis, especialmente mandarinas. Como se remarca en la Figura 1, la severidad promedio de la antracnosis (tamaño de la lesión) en frutas control inoculadas artificialmente y sin recubrir fue de 47,29 mm en mandarinas, mientras que solo de 15,2 mm en naranjas. Dado que la densidad del inóculo y la metodología utilizada fueron exactamente las mismas para ambos tipos de fruta, estos valores indican que la susceptibilidad a la antracnosis fue mucho menor en naranjas que en mandarinas. Esta es una característica que se ha observado previamente para otras enfermedades poscosecha de cítricos, como las podredumbres verde y azul causadas por Penicillium spp., y que puede estar relacionada con las propiedades físicas y bioquímicas de la corteza del fruto (Palou et al., 2016; Smilanick et al., 2020).
Existen diversos estudios previos sobre el uso de aditivos alimentarios, como AC, SC, SB o SBC, para controlar la antracnosis de poscosecha en diferentes cultivos, pero en la mayoría de casos los aditivos se aplicaron sumergiendo la fruta en soluciones acuosas (De Costa y Gunawardhana, 2012; Hasan et al., 2012; Sivakumar et al., 2002). En cambio, el número de trabajos sobre el uso de RCs o ceras para controlar la antracnosis causada por Colletotrichum spp. en diversos productos frescos es bastante bajo y, en general, los RCs más estudiados son las aplicaciones de quitosano u otras matrices comestibles que contienen aceites esenciales como ingredientes antifúngicos (Ali et al., 2016; Bill et al., 2014; Lima Oliveira et al., 2018). Por tanto, hasta donde sabemos, este es el primer trabajo en el que se han probado aditivos alimentarios como parte de RCs formulados a base de HPMC–BW para controlar la antracnosis poscosecha de los cítricos, obteniéndose una capacidad antifúngica reseñable.
Efecto de los recubrimientos seleccionados en la calidad de naranjas frigoconservadas
El Cuadro 2 muestra que tras 28 y 56 días de almacenamiento a 5ºC, seguidos de 7 días de vida comercial a 20ºC, ninguno de los RCs probados mejoró la pérdida de peso de las naranjas e incluso el formulado con PS la incrementó, debido posiblemente a cambios inducidos por este RC en la permeabilidad de la cutícula. La firmeza del fruto se redujo respecto al valor en cosecha, pero no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos. Respecto a la calidad del zumo, en general, las naranjas recubiertas con HPMC–BW–SB y HPMC–BW–PSi tuvieron menor CSS que la fruta control después de ambos períodos de almacenamiento, pero no se observaron diferencias significativas en la AT y el IM entre los frutos control y los recubiertos. Estos resultados concuerdan con lo previamente reportado en otros estudios con RCs de este tipo en cítricos (Guimarães et al., 2019; Valencia–Chamorro et al., 2010).


Cuadro 2. Parámetros de calidad en naranjas ‘Valencia Late’ recubiertas con recubrimientos comestibles a base de hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), cera de abeja (BW) y aditivos alimentarios y almacenadas durante 28 o 56 días a 5ºC más 7 días de vida comercial a 20ºC.
1 CSS: contenido en sólidos solubles, AT: acidez titulable, IM: índice de madurez. Se indican las medias ± el error estándar (SE). Las medias en la misma columna con diferentes letras son significativamente distintas según la prueba de la MDS de Fisher aplicada después de un ANOVA (P < 0,05).
2 Ver apartado 2 de Material y métodos.
Por otro lado, la Figura 2 muestra que todos los RCs modificaron la atmósfera interna de la fruta, aumentando su concentración de CO2; sin embargo, ninguno afectó negativamente a su calidad ya que el aumento de volátiles (Cuadro 2), principalmente el etanol, no llegó a los límites que inducen malos sabores reportados en trabajos previos con cítricos (Navarro–Tarazaga y Pérez–Gago, 2006; Shi et al., 2007). En el análisis sensorial no existieron diferencias significativas ni en el sabor global de la fruta (5,7–5,5–5,3–5,6; siendo estos valores los promedios para los tratamientos Control, HPMC–BW–PS, HPMC–BW–SB y HPMC–BW–PSi respectivamente) ni en la presencia de malos sabores (1,3–1,3–1,8–1,3). El aspecto de los RCs no mejoró respecto al control, siendo los que contenían PSi los de mejor aspecto (datos no mostrados).


Figura 2. Concentraciones internas de CO2 (A) y O2 (B) en naranjas ‘Valencia Late’ recubiertas con recubrimientos comestibles a base de hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), cera de abeja (BW) y aditivos alimentarios (ver apartado 2 de Material y métodos) y almacenadas durante 28 o 56 días a 5ºC más 7 días de vida comercial a 20ºC.
Para cada periodo de almacenamiento, las columnas con letras diferentes indican medias significativamente diferentes según la prueba de la MDS de Fisher aplicada después de un ANOVA (P < 0,05). Las líneas verticales encima de las columnas indican el error estándar (SE).
Los resultados obtenidos en este estudio confirman que los RCs de HPMC–BW con PS, SB o PSi son alternativas potenciales no contaminantes para reducir la severidad de la antracnosis de poscosecha en cítricos sin afectar negativamente la calidad de la fruta durante periodos largos de frigoconservación. Futuros estudios deben centrarse en mejorar las características físicas y el aspecto de estos RCs. Puesto que RCs similares resultaron efectivos previamente en otros patosistemas (Fagundes et al., 2013; Guimarães et al., 2019; Gunaydin et al., 2017; Karaca et al., 2014), estos resultados confirman el amplio espectro de acción antifúngica de este tipo de RCs conteniendo aditivos alimentarios antifúngicos. Además, estos resultados son especialmente importantes en el caso de los cultivares de mandarinas y naranjas más tempranos, ya que son desverdizados artificialmente con etileno exógeno para obtener el color naranja apropiado en su corteza antes de la comercialización. La exposición a este gas en condiciones ambientales típicas de desverdización (20–22ºC y HR > 90%) estimula la germinación de conidios y la formación y germinación de apresorios de C. gloeosporioides y, por tanto, exacerba el desarrollo de infecciones latentes y la incidencia de la antracnosis de poscosecha en frutos cítricos (Smilanick et al., 2020). En este caso, los síntomas de la enfermedad en fruta desverdizada suelen aparecer como extensas lesiones de color gris plateado y consistencia firme y correosa (Foto 5).


Foto 5. Síntomas de antracnosis causada por Colletotrichum gloeosporioides en naranjas infectadas de forma natural y desverdizadas mediante exposición a etileno exógeno.
Dado que el desverdizado de los cítricos se realiza normalmente antes del procesado de la fruta, la aplicación de estos RCs antifúngicos en la línea de empaque podría ser un tratamiento curativo adecuado contra la antracnosis y sustituir eficazmente el uso de ceras que incorporan fungicidas químicos sintéticos.
Los autores agradecen la colaboración prestada en el suministro de fruta y asistencia técnica a Fontestad S.A. (Montcada, València). Este estudio fue parcialmente financiado por el INIA (proyecto RTA2012–00061–00–00), el IVIA (proyecto Nº 51910) y cofinanciado por la Unión Europea a través del Programa Operativo del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) de la Comunitat Valenciana 2014–2020. La Dra. Victoria Martínez–Blay disfruta de una beca financiada por el IVIA y el Fondo Social Europeo (FSE).
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